Las enfermedades cardiovasculares continúan siendo la principal causa de morbilidad y mortalidad a nivel mundial. El evento común que desencadena crisis cardiacas son los coágulos sanguíneos.
Para prevenir futuras crisis de salud y tener una población más saludable es importante conocer el problema por medio de investigaciones. CONARE apoya a las universidades públicas en la misión de crear innovación y conocimiento para toda la población.
Antes de leer los resultados de esta investigación recomendamos leer este pequeño glosario creado para todas las personas que tan solo sabemos sumar, restar, dividir y multiplicar.
- Factor VIII: Es una glicoproteína necesaria para la coagulación.
- RMN de proteínas: esto es un examen utilizado para observar la estructura y dinámica de las proteínas por medio de una Resonancia Magnética Nuclear (RMN).
- Trombina: es una enzima que se encuentra en el plasma de la sangre. Al igual que el Factor VIII, también forma parte del proceso de coagulación.
- FVIIIa2: (marcado con carbono-13) partes de la glicoproteína Factor VIII ricas en residuos ácidos que preceden los sitios de corte y activación de la trombina (Carvajal, Arce, Mena, Fuentes; 2016. p. 80)
- FVIIIa3: (marcado con nitrógeno-15) partes de la glicoproteína Factor VIII ricas en residuos ácidos que preceden los sitios de corte y activación de la trombina (Carvajal, Arce, Mena, Fuentes; 2016. p. 80)
- FVIIIa3: (marcado con nitrógeno-15) partes de la glicoproteína Factor VIII ricas en residuos ácidos que preceden los sitios de corte y activación de la trombina (Carvajal, Arce, Mena, Fuentes; 2016. p. 80)
- Agentes denaturalizantes: Los agentes que provocan la desnaturalización de una proteína. Se distinguen agentes físicos (calor) y químicos (detergentes, disolventes orgánicos, pH, fuerza iónica). (ehu.eus; s.f)
Objetivo
Esta investigación tuvo como objetivo general la evaluación de las interacciones de los fragmentos recombinantes del factor VIII marcados con carbono-13 y nitrógeno-15 (FVIII a2 y FVIII a3) con la trombina mediante la implementación de ensayos de resonancia magnética nuclear (RMN) de proteínas en solución.
Principales resultados
1.
‘’Se logró estandarizar las condiciones de clonación, sobreexpresión, purificación e identificación para la producción de la proteína recombinante humana FVIIIa3, en forma soluble con alto rendimiento y alta calidad en medio Luria Bertani (LB).’’’
Este avance permite a las personas investigadoras trabajar de manera más eficiente y precisa ya que pueden tener seguridad en que la proteína recombinante FVIIIa3 producida en laboratorio siempre va a tener las mismas características y propiedades.
2.
‘’Se logró determinar, que en un gran número de condiciones, la proteína recombinante FVIIIa2 humana se produce de forma insoluble, con un bajo rendimiento. Esta solo se logra extraer mediante el uso de agentes desnaturalizantes (urea), lo que hace que la posible información que se obtenga mediante RMN no refleje la realidad de las condiciones biológicas funcionales que interesan en esta investigación.‘’
Esta inconsistencia en la proteína FVIIIa2 resultado de las condiciones en las que se debe dar la técnica de extracción, desafortunadamente, significa que la resonancia magnética nuclear no refleje con completa precisión las condiciones que la investigación observa.
3.
‘’Se logró estandarizar la sobreexpresión y purificación del FVIIIa3 en medio mínimo (M9) enriquecido con carbono-13 (13C) y nitrógeno-15 (15N), para el marcaje de la proteína de interés, FVIIIa3, con isótopos no radiactivos como fase preparatoria para los ensayos de RMN de proteínas.’’
En circunstancias naturales el FVIIIa3 (producido en bacterias para esta investigación) posee carbono-12 y nitrógeno-14. En esta investigación se les agregó un isótopo ‘’extra’’, lo que resulta en carbono-13 y nitrógeno-15. Este isótopo (no radiactivo) adicional permite a las bacterias que ‘’producen’’ el FVIII producir azúcares y sales para que puedan nutrirse y vivir lo suficiente para realizar estudios.
4.
Se implementó por primera vez en Costa Rica, en el equipo Bruker 600 MHz, los ensayos de resonancia mono-dimensionales de protón [1H] y bi-dimensionales de protón-nitrógeno [1H-15N] para macromoléculas biológicas. Particularmente, la proteína heteróloga humana del FVIIIa3 marcada con carbono-13 y nitrógeno-15, permitió estandarizar las condiciones de colecta de los datos para la generación de los espectros de resonancia mono y bi-dimensionales del fragmento FVIIIa3 recombinante solo y en presencia de trombina, para la evaluación de sus resonancias.
El uso de estos equipos especializados permiten a las personas investigadoras estudiar las proteínas desde múltiples ‘’perspectivas’’, esto ayuda a obtener información más precisa y visualmente simplificada para su estudio. La resonancia mono-dimensional permite ver en un plano la ubicación de las proteínas como puntos o ‘’vértices’’. La resonancia bi-dimensional permite visualizar en qué zonas interactúan la trombina y el factor VIII, como si conectáramos los vértices de una figura y esta tomara forma.
5. Se implementó, también por primera vez en Costa Rica, un conjunto de experimentos de RMN de triple resonancia de protón, nitrógeno y carbono [1H, 15N y 13C] para macromoléculas biológicas. El conjunto de experimentos diseñados y colectados fueron los HNCO, HNCA, HNcoCA, HNCACB, CACBcoNH. A partir de cada uno de los experimentos se lograron colectar los respectivos espectros tridimensionales de resonancia, tanto del fragmento FVIIIa3 recombinante solo, como en presencia de trombina.
6. Con la información integrada de todos los ensayos de triple resonancia, se logró asignar más del 90% de las resonancias a los residuos aminoacídicos específicos del fragmento FVIIIa3 solo y en presencia de trombina.
7. A partir de la información obtenida con todos estos experimentos RMN en solución, se logró identificar los residuos de los fragmentos del FVIIIa3 que interaccionan con la trombina.
8. Los datos de RMN colectados se lograron llevar a procesar, analizar y refinar en colaboración con el Institut d’Investigació Biomèdica (IIB-SantPau) en Barcelona, favoreciendo la cooperación y el intercambio internacional de conocimientos.
9. Se está terminando de realizar la asignación específica de las resonancias a los residuos aminoacídicos del fragmento del FVIIIa3 solo y en presencia de trombina.
10. Como resultados adicionales a lo planteado en este proyecto, también se realizaron ensayos bi-dimensionales de RMN del fragmento recombinante FVIIIa3 en presencia de trombina inhibida con 3 moléculas inhibitorias diferentes.
11. Se logró enviar a una estudiante a una pasantía de 5 semanas, al Laboratorio Biomolecular de RMN en el Instituto Científico San Raffaele, Hospital de San Raffaele, en Milán (Italia), para el aprendizaje de técnicas de cristalografía y resonancia magnética nuclear (RMN) de proteínas.
Equipo de investigación
Dr. Erick Hernández-Carvajal (TEC)
Dr. Godofredo Solano Arias (UCR) 
M.Ed. Javier Alvarado Mesén (UNA) 
Dra. Gina Porras Brenes (CENIBiot).
Asistentes y estudiantes
- Silvia Arce Solano (TEC)
- Didier Mena Aguilar (TEC)
- María Fernanda Castro (TEC)
- Jeremy Rojas Murcia (TEC)
- Mónica Zamora Rodríguez (UNA)